科普讲堂视频全集，rna的提取与检测

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RNA介绍

核糖核酸(RNA,即Ribonucleic Acid），基因信息载体存在于生物细胞中以及某些病毒和类病毒中。RNA是一个链状的分子,由核苷酸生长,由磷酸二氧化物键结合。核苷酸分子是由磷酸盐组成的,核糖和碱基构成。RNA有四个基本基础,例如A(腺素),G(鸟素),C(cytocybin),U(氨基),其中，U（尿嘧啶）取代了DN的T（胸腺嘧啶）。核酸在人体的作用主要是指导蛋白质合成.

RNA提取(TRlzol提取方法)

1．取样，研磨（组织）：迅速取出组织样本，在电子天平中称重约0.3-0.5 g（也可根据实际经验估测取样量），放入液氮预冷的研钵中，边研磨边加液氮，整个过程都不要使组织融化。

2．裂解：

(1)组织:每100毫克组织1毫升TRIzol,继续研磨至细粉,将组织裂变液输送到一个离心管中,每管约1 mL，在室温15分钟或以上放置;也可以直接用枪头将研磨的细粉碎成一个已修复的粉末,其中含有1毫升 TRIzol.5毫升,放在离心管中,放置在4°C10分钟,或在室温以上15分钟放置;

细胞:悬挂细胞需要预处理:4°C,3000 rpm，离心10 min，收集在心脏管底部储存1.5毫升的细胞;将培养液丢弃,加一次适当的1xPBS洗涤剂,弃去1xPBS，加入1毫升TRIzol(根据细胞数目(1毫升/0.5-1x107)或培养瓶面积(1毫升/10厘米2)的TRIzol剂量,用移液器轻吹打几次，超清洁的太chung房间温度放置超过15分钟,将1毫升的液体转移到室温中1.5毫升。

(3)若未立即提取,则可以在80°C的冰箱内冻结。

画: 单击0.2毫升氯化物 / 1毫升 TRIzol 加入氯化物,vortex 30 sec或用手剧烈摇动15 sec，放置在室温2-3分钟后, 4℃，12000 rpm，离心处15分钟;小心地移入 centrifugal管中,再用1.5毫升,不要吸取中间层。

4. 沉积: 以异丙醇/血清比例添加异丙醇=1:1,上下颠倒混匀，-20°C后30分钟,4℃，1200 rpm 15 分弃上清，不要再带太多的异丙烯醇,可再短暂离心，剩余的异丙烯醇通过导体吸出.

5．漂洗：加入1 mL 75％乙醇，用手指将沉淀块弹起，上下颠倒几次，4℃，12000 rpm 离心5 min。弃上清，75％乙醇不要回流过多，可再短暂离心，用移液器将剩余的75％乙醇吸出。

6. 风干，溶解：超净台中自然干燥 5-10 min，不要真空离心干燥， RNA不要完全干透，以防不能完全溶解；用DEPC水溶解RNA，60-65℃助溶 5-10 min。

7. 定量: 如果 RNA 总数 没有 立即 定量, 样品 将 在 80°C 储存 。

RNA定量

我们通常通过纳米滴紫外光谱仪测定RNA样品在260nm的吸收值来计算RNA含量。但是，DNA和RNA都吸收紫外线光.其性质是紫环和紫环的共轭双键系统。因此,紫氨酸和三硝胺以及它们所含的所有物质,核苷酸、核苷酸或核苷酸都有吸收紫外线光的特性。所以紫外线不能区分DNA和RNA,它只能用于确定核酸的纯度和含量.

纳米滴紫外光谱仪可以得到以下参数:

OD230:吸收杂质(酚、碳水化合物等);

OD260:核酸的吸收;

OD280:蛋白质的吸收;

OD260/280:纯RNA比率为1.5-2。在1之间,如果值较低,则意味着被蛋白质污染;

OD260/230:纯RNA比率为2.0至2.在5之间,如果比率低,则意味着含糖、肽、酚等有机物质的污染。

RNA完整性鉴定

我们通常使用电泳法、Agilant 2100和其他仪器来测定RNA的完整性

RIN值

RIN（RNA integrity number）代表RNA完整性的数值，对total RNA的完整性进行数字化的评估，范围在1 ~10，数值越接近10表明样品完整性越高，反之完整性越差，如下图所示。

RNA分解对每个序列项目的影响

转录组序列: degradation程度会影响5'末的数据质量;

2微RNA序列:由于碎片本身较小,降解效果较小;

分解组序列:如果外部分解返回内部分解,则效果更大;

4lncRNA和 circRNA序列: rRNA除去方法建立存储器,样品的分解效果不大。

核污染对测量项目的影响

1记录组序列:一般不影响数据,在轻微污染时可以忽略,在污染更严重时需要增加图书馆的起始量;

2micRNA序列:对数据的影响很小,通常是污染比例对数据比和有效数据量的影响,光污染时可以忽略,污染比例较高时则必须增加数据量;

分解组:转录组的情况;

4 lncRNA 和 circRNA 序列: 结果是巨大的,而且存储方法确定,如果被污染,如果没有处理,数据可能完全无用,因此需要高度的警惕。

常见问题分析

得率低：

1样品没有彻底裂缝或粉碎;

RNA沉积尚未完全溶解.

A260/A280<1.65（RIN<7）：

在检测吸收时,RNA样品不溶于水中,而是在TE中。 在低离子浓度和低pH条件下,A280的含量很高。

2样品均匀时添加的试验剂量太小;

在均匀化过程中,不要将样品放在室温下5分钟;

有机相在吸收水相时混合;

RNA沉积尚未完全溶解。

RNA降解：

切除后组织不立即处理或冻结;

将提取的RNA样品储存在-5至-20°C;

用胰岛素治疗的3个细胞过活;

4不除RNase的溶液或 centrifuge;

电泳中使用的甲醛的pH低于3.5。

DNA污染：

1样品均匀时增加的试验剂量太小;

2样品含有有机溶剂(例如乙醇,DMSO等)，强缓冲剂或碱性溶液多糖和多糖污染:这些污染可以通过以下改进RNA降水过程消除:步骤7中，每使用1ml TRIzol在水相中加0.25ml异丙醇和0.25ml高盐溶液(0.8M柠檬酸钠和1.2M NaCl)混合离心，按之前操作进行。这种方法允许蛋白质多糖和多糖留在溶液中,高效率的纯RNA降水.当从含有大量多糖的植物提取RNA时,它应在均匀化后溶解。加入上述操作步骤。

王俊杰 | 文案

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